Trong nghiên cứu dược liệu, để có thể thu được chính xác dược liệu mong muốn, người nghiên cứu cần có những kiến thức cần thiết về loài đó như tên khoa học, đặc điểm về hình thái cơ quan sinh dưỡng, sinh sản và bộ phạn dùng. Bằng phương pháp quan sát và so sánh đặc điểm hình thái của dược liệu với các tài liệu đã được mô tả có thể xác định được loài cần thu hái. Tuy nhiên, với sự đa dạng của thực vật, rất nhiều loài trong cùng một chi có hình thái rất giống nhau, có thể gây nhầm lẫn trong quá trình thu hái. Do đó, để có thể phân biệt được các loài này cần sử dụng các phương pháp nghiên cứu khác hỗ trợ. Hiện nay, có thể sử dụng phương pháp sinh học phân tử trong việc định danh, song các kỹ thuật này khá tốn kém và mất nhiều thời gian. Một phương pháp cổ điển, đơn giản và dễ thực hiện ở tất cả các phòng thí nghiệm đó chính là phương pháp vi học, thực hiện giải phẫu các cơ quan sinh dưỡng và quan sát cấu tạo. Để có thể phân biệt được các mô một cách dễ dàng và chính xác trong phương pháp vi học cần có kỹ thuật nhuộm hỗ trợ.

Kỹ thuật nhuộm được ra đời nhờ sự nghiên cứu của nhà khoa học Leuweenhook, ông đã sử dụng các loại thuốc nhuộm saffron, indigo, madder để nhuộm các mô và quan sát chúng dưới các kính hiển vi thô sơ.

Nhuộm là thao tác cần thiết trong nghiên cứu mô học, tế bào học nói chung và với thực vật nói riêng. Bởi mô được cấu tạo bởi các tế bào giống nhau về cấu trúc và cùng đảm nhiệm một chức năng. Các mô khác nhau sẽ được cấu tạo bởi các loại tế bào khác nhau. Bằng phương pháp nhuộm, dựa vào các khác biết về cấu trúc của tế bào mà có thể dễ dàng phân biệt các mô.

Đối với các thực vật đơn bào như tảo, nấm và rêu, bào tử của dương xỉ sẽ được nhuộm đơn. Các loại tảo và rêu thường được nhuộm với một vài giọt aniline blue hay safranin trong vài phút. Ngoài ra, aniline blue, fast-green, acetocarmine and haematoxylin là một số loại thuốc nhuộm cũng thường được sử dụng trong quan sát tảo, để loại bỏ thuốc nhuộm dư, có thể rửa mẫu với nước cất nhiều lần hoặc với nước trong điều kiện acid hay với cồn nước. Đối với nấm, lactophenol cotton blue được sử dụng để nhuộm.

Đối với thực vật ngành hạt trần và hạt kín sẽ sử dụng phương pháp nhuộm kép do đây là các thực vật đa bào, được cấu tạo bởi rất nhiều tế bào và các mô khác nhau. Các cơ quan sẽ được cắt dọc hoặc cắt ngang bằng dao lam hoặc bằng máy cắt vi phẫu. Mỗi lát cắt cần đạt yêu cầu thẳng góc và mỏng từ một đến vài lớp tế bào thì mới có thể quan sát được cách sắp xếp của các mô bên trong cơ quan. Ở Việt Nam, phổ biến nhất là cách nhuộm kép với đỏ carmin và xanh methylen hoặc lục iod. Với phương pháp này, các lát cắt sẽ được tẩy màu bằng javel hoặc bằng cloramin B. Sau đó rửa sạch dung dịch tẩy màu bằng nước cất, ngâm các lát cắt trong acid acetic 10% trong 10 – 15 phút. Cuối cùng, nhuộm xanh methylen hoặc lục iod trước trong khoảng thời gian 5 – 30 giây, rửa lại với nước cất rồi sau đó nhuộm đỏ với dung dịch carmin. Với phương pháp nhuộm này, những mô nào có vách bằng cellulose hoặc mô sống sẽ có màu hồng, mô có vách tẩm chất bần hay chất gỗ hoặc mô chết sẽ có màu xanh lá, xanh dương hoặc vàng chanh. Sự nhuộm màu của vách tế bào khi sử dụng thuốc nhuộm toluidine blue. Đối với phương pháp nhuộm sử dụng đỏ safranin và xanh methyl, các lát cắt được nhuộm trong safranin trong ba phút, sau đó rửa lại ba lần với cồn 70% trong 1 phút. Sau khi loại bỏ cồn, sử dụng xanh methyl và nhuộm trong một phút. Rửa lại mẫu với cồn 95% ba lần, mỗi lần 1 phút. Đối với thuốc nhuộm này, những tế bào có vách bằng cellulose hoặc mô sống sẽ bắt màu xanh lá hoặc xanh dương, tế bào có vách tẩm chất gỗ hay chất bần hoặc mô chết sẽ bắt màu đỏ hoặc đỏ cam.

Ngoài phương pháp nhuộm truyền thống hỗ trợ trong định danh thực vật giúp nhận biết đúng dược liệu, tùy thuộc vào các nghiên cứu khác như nghiên cứu phát sinh hình thái thực vật, sẽ kết hợp các loại thuốc nhuộm trên với những loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang khác. Ví dụ như nghiên cứu sự hình thành và phát sinh của ngoại bì và nội bì ở rễ. Giai đoạn đầu và giai đoạn thứ hai hình thành nội bì và ngoại bì có thể được phân biệt nhờ vào việc nhuộm berberin hemisulphat hoặc fluorol yellow 088 trong polyethylen glycol glycerol. Việc tẩm chất bần để hình thành vòng đai Caspary có thể quan sát bằng kính hiển vi với tia UV khi nhuộm berberin. Ở giai đoạn tẩm chất bần thứ hai, có thể quan sát bằng cách nhuộm với fluorol yellow 088 và quan sát dưới tia UV. Những lát cắt này sau khi được nhuộm với berberin hoặc fluorol yellow sẽ được rửa với acid lactic sau đó tiếp tục được nhuộm với các thuốc nhuộm toluidine blue hoặc với safranin để có thể phân biệt được các mô khác.

A. Lux, S. Morita, J. Abe and K. Ito, “An Improved Method for Clearing and Staining Free-hand Sections and Whole-mount Samples”, Annals of Botany, 96, p. 989–996, 2005.

R. Crang, S. L. Sobaski and R. Wise, Plant Anatomy: A Concept-Based Approach to the Structure of Seed Plants, Springer, p. 336, 2019.

Lê Thu Thủy